Erweiterte Profilierung von Remdesivir als Breitband

Jul 12, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3131 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Remdesivir (GS-5734; VEKLURY) ist ein Einzeldiastereomer-Monophosphoramidat-Prodrug eines Adenosinanalogons (GS-441524). Remdesivir wird von Zielzellen aufgenommen und in mehreren Schritten metabolisiert, um das aktive Nukleosidtriphosphat (GS-443902) zu bilden, das als starker Inhibitor viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerasen wirkt. Remdesivir und GS-441524 haben eine antivirale Aktivität gegen mehrere RNA-Viren. Hier erweitern wir die Bewertung der antiviralen Aktivität von Remdesivir auf Mitglieder der Familien Flaviviridae, Picornaviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae und Hepadnaviridae. Mithilfe zellbasierter Tests zeigen wir, dass Remdesivir die Infektion von Flaviviren (wie Dengue 1–4, West-Nil-Viren, Gelbfieber, Zika-Viren), Picornaviren (wie Enteroviren und Rhinoviren) und Filoviren (wie verschiedene Ebolaviren, Marburg- und Sudan-Virusisolate, einschließlich neuartiger geografischer Isolate), ist jedoch unwirksam oder deutlich weniger wirksam gegen Orthomyxoviren (Influenza-A- und -B-Viren) oder Hepadnaviren B, D und E. Darüber hinaus zeigt Remdesivir in Kombination keine antagonistische Wirkung mit Favipiravir, einem weiteren breit wirkenden antiviralen Nukleosidanalogon, und weist nur minimale Wechselwirkungen mit einer Reihe von Begleitmedikamenten auf. Unsere Daten belegen darüber hinaus, dass Remdesivir ein antiviraler Breitbandwirkstoff ist, der das Potenzial hat, mehrere ungedeckte medizinische Bedürfnisse zu erfüllen, einschließlich solcher im Zusammenhang mit der antiviralen Pandemievorsorge.

Remdesivir (RDV; GS-5734; VEKLURY), das erste von der FDA zugelassene antivirale Mittel zur Behandlung von COVID-19, ist ein einzelnes Diastereomer-Monophosphoramidat-Prodrug eines Adenosinanalogs (GS-441524). Sobald RDV von Zellen aufgenommen wird, wird es in mehreren Schritten metabolisiert, um das aktive Nukleosid 5′-Triphosphat (TP) zu bilden, einen wirksamen Inhibitor mehrerer viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerasen. RDV weist eine Breitbandaktivität gegen viele RNA-Viren in Zellkulturen auf, darunter Coronaviren (SARS-CoV-2, SARS-CoV und MERS-CoV)1,2,3,4,5,6,7, Picornaviren (Enterovirus 71). [EV71] und Coxsackievirus B3)8, Filoviren (Ebola-Virus [EBOV], Sudan-Virus [SUDV], Bundibugyo-Virus, Marburg-Virus [MARV])9,10,11, Pneumoviren (Respiratory Syncytial Virus [RSV])10,11 ,12 und Paramyxoviren (Nipah-Virus [NiV], Masernvirus und Hendra-Virus)13,14. RDV hat eine mäßige Aktivität gegen das Lassa-Virus und das Junin-Virus in der Familie der Arenaviridae sowie gegen das durch Zecken übertragene Alkhurma-Hämorrhagische-Fieber-Virus, das Kyasanur-Forest-Disease-Virus, das Omsk-Hämorrhagische-Fieber-Virus und das durch Zecken übertragene Enzephalitis-Virus in der Familie der Flaviviridae10,13. RDV hat eine minimale antivirale Aktivität gegen das Chikungunya-Virus und das venezolanische Pferdeenzephalitis-Virus in der Familie der Togaviridae, das humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) in der Familie der Retroviridae, das Rift-Valley-Fieber-Virus in der Familie der Phenuiviridae und das hämorrhagische Krim-Kongo-Fieber-Virus in der Familie Nairoviridae-Familie und das vesikuläre Stomatitisvirus in der Rhabdoviridae-Familie10,13. Die Gründe für Variationen im Aktivitätsprofil sind unbekannt, spiegeln jedoch wahrscheinlich subtile Unterschiede im aktiven Zentrum viraler RNA-abhängiger RNA-Polymerasen wider15.

In dieser Studie haben wir die Bewertung der antiviralen Aktivität von RDV auf andere Mitglieder der Familien Flaviviridae, Picornaviridae, Filoviridae (mit neuen Stämmen), Orthomyxoviridae und Hepadnaviridae ausgeweitet. Zur Vorbereitung auf eine Pandemie und für den Fall, dass mehrere Medikamente kombiniert werden müssen, um die antivirale Aktivität und damit die Wirksamkeit zu verbessern, zeigen wir in antiviralen Tests gegen zwei repräsentative Filoviren auch einen fehlenden Antagonismus zwischen RDV und Favipiravir, einem anderen zugelassenen breit antiviralen Nukleosidanalogon. Darüber hinaus zeigen wir, dass es keinen Antagonismus zwischen RDV und einer Reihe von Begleitmedikamenten gibt, die üblicherweise in SUDV- und MARV-endemischen Regionen eingesetzt werden.

Die Wirksamkeit von RDV gegen RSV und verschiedene Coronaviren in vitro wurde ausführlich untersucht1,3,4,5,6,7,12. Wir bestätigen, dass RDV wirksam gegen das endemische OC43- und 229 E-Coronavirus ist, mit einem EC50-Wert von 0,067 µM in Huh7-Zellen bzw. 0,093 µM in H1-HeLa-Zellen (Tabelle 1). In zellbasierten Infektionstests hemmte RDV die Enteroviren 68D und 71 mit EC50-Werten von 0,050 bzw. 0,140 μM. Die Wirksamkeit von RDV gegen Rhinoviren der Serotypen A und B lag im Bereich von EC50-Werten von 0,385 bis 0,750 μM in H1-HeLa-Zellen. Umgekehrt war RDV gegen Influenza A und B inaktiv (EC50 > 50 μM; Tabelle 1).

Die Aktivitäten von GS-441524 gegen Dengue-Virus-2 (DENV-2), Gelbfiebervirus (YFV) und West-Niles-Virus (WNV) wurden mit EC50-Werten von 9,46, 11 bzw. > 30 µM angegeben19. In dieser Studie wurde die RDV-Aktivität gegen Flaviviren in zellbasierten Infektionstests bewertet. Huh-7-Zellen wurden mit steigenden Konzentrationen der Verbindung behandelt und anschließend DENV 1–4, Zika-Virus (ZIKV), YFV oder Japanisches Enzephalitis-Virus (JEV) ausgesetzt, die ein Nano-Luciferase-Reporterprotein exprimieren. Die Luciferase-Aktivität wurde am Endpunkt des Tests als Ergebnis einer Virusinfektion gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde am gleichen Zelltyp mithilfe eines ATP-basierten Lumineszenztests zur Messung der Zytotoxizität getestet. RDV reduzierte die Infektion durch alle diese Flaviviren mit der höchsten Wirksamkeit gegen DENV (EC50-Bereich = 0,12–0,23 μM; Tabelle 1) und der niedrigsten Wirksamkeit gegen YFV (EC50 = 1,06 μM; Tabelle 1). Die antivirale Aktivität von RDV gegen WNV wurde auf ähnliche Weise bewertet, mit der Ausnahme, dass die Virusinfektionsraten über Plaque-Assays von Kulturmedien am Assay-Endpunkt gemessen wurden. RDV war ein wirksamer Inhibitor der WNV-Infektion (EC50 = 0,05 μM; Tabelle 1).

Über die antivirale RDV-Aktivität gegen Filoviren wurde bereits in In-vitro- und In-vivo-Infektionsmodellen berichtet9,10,11,13,20. Diese Studien konzentrierten sich jedoch auf Filoviren wie die EBOV-Varianten Kikwit, Makona und Yambuku (Isolat Mayinga), die SUDV-Variante Gulu und die MARV-Varianten Angola und Hesse (Isolat Cieplik, auch bekannt als „Ci67“) (zusammengefasst in Tabelle 1). Um die antivirale Aktivität von RDV gegen geografisch und zeitlich unterschiedliche Filovirus-Isolate zu untersuchen, wurden Dosis-Wirkungs-Studien in menschlichen HeLa-Zellen durchgeführt und die Virusinfektionsraten wurden anhand der viralen Antigenfärbung am Assay-Endpunkt bestimmt10,21,22. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde gleichzeitig durch Kern- und Zytoplasmafärbung der Testvertiefungen bewertet. Wie in Tabelle 1 zusammengefasst, war RDV ein wirksamer Inhibitor aller getesteten MARV- und Ravn-Virus (RAVV)-Isolate mit EC50-Werten von 0,024–0,068 μM. Eine starke, wenn auch weniger starke Aktivität wurde auch gegen alle getesteten SUDV-Isolate beobachtet (EC50-Werte von 0,12–0,24 μM).

Frühe Studien zeigten, dass GS-441524 und RDV mit einem EC50-Wert von 3,1 µM bzw. 0,057 µM gegen das HCV-1b-Replikon aktiv sind11,19. In dieser Studie haben wir die RDV-Aktivität sowohl gegen den HCV-Genotyp 1b als auch gegen den HCV-Genotyp 2a mithilfe eines subgenomischen Replikonsystems bewertet, bei dem die Renilla-Luciferase-Reporterspiegel als Maß für die Virusreplikation dienen. RDV hemmte die Replikonaktivität beider HCV-Genotypen mit ähnlicher Wirksamkeit (EC50 = 0,072–0,089 μM; Tabelle 1).

RDV wurde auf antivirale Aktivität gegen das Hepatitis-B-Virus (HBV; AD38-Stamm) in HepG2- oder PHH-Zellen getestet. Die beobachtete Wirksamkeit von RDV ähnelte der CC50 der Verbindung in diesen Zellen. Daher liegt der Selektivitätsindex von RDV gegenüber HBV nahe 1, was darauf hindeutet, dass die Zytotoxizität von RDV die wahrscheinliche Ursache für die in unseren Tests gemessene antivirale Wirkung ist. RDV ist in Huh-7-Zellen mit einem EC50 > 5 µM inaktiv gegen HDV. Darüber hinaus war RDV bei Konzentrationen von bis zu 1 µM inaktiv gegen das Hepatitis-E-Virus (GT3-Kernow C1 p6/Luciferase-Replikon). Höhere Konzentrationen wurden nicht versucht, da bei Konzentrationen von etwa 4 µM Zytotoxizität beobachtet wurde.

Favipiravir (Avigan, T-705) ist ein Nukleosidanalogon mit Breitbandaktivität gegen RNA-Viren wie Arena-, Bunya-, Nairo-, Flavi- und Filoviren23,24. Es wurde 2014 in Japan zugelassen, war jedoch auf die Behandlung neuartiger oder wieder auftretender Influenzavirus-Infektionen (nicht der saisonalen Influenza) beschränkt, gegen die andere antivirale Influenza-Medikamente unwirksam sind25,26.

Unter der zugelassenen Dosis (1600 mg zweimal täglich am Tag 1; 600 mg zweimal täglich an den Tagen 2–5) zeigte Favipiravir nach kontinuierlicher Anwendung eine zeitabhängige Abnahme der Exposition sowohl bei gesunden Freiwilligen27,28 als auch bei Patienten mit Ebola-Virus-Erkrankung29. In der JIKI-Studie 2014–2015 (einer experimentellen Behandlung mit Favipiravir gegen die Ebola-Viruserkrankung) führte eine höhere Dosis (2400 mg + 2400 mg + 1200 mg am Tag 0; 1200 mg BID an den Tagen 1–9) zu einer mittleren Plasmakonzentration von 46,1 μg/ml (~ 310 μM) am Tag 2, mit einem Rückgang um ~ 50 % am Tag 4 (25,9 μg/ml, ~ 170 μM)29. In unserem zellbasierten Infektionstest zeigte Favipiravir eine geringe antivirale Aktivität gegen SUDV und MARV mit EC50-Werten von 507 ± 79,9 bzw. 113 ± 9,8 µM (Tabelle S1 und S2). Wir haben auch die Aktivitäten von RDV in Kombination mit klinisch relevanten Favipiravir-Konzentrationen (23–750 μM) gegen SUDV- (Tabelle S1) und MARV-Infektionen (Tabelle S2) bewertet. Der EC50-Wert von RDV wurde in Gegenwart von Favipiravir dosisabhängig reduziert (Tabelle S1 und S2; maximal ≥ 5-2- bzw. ≥ zehnfache Reduktion für SUDV bzw. MARV). Die Wirkung der Verbindungskombination auf den EC50-Wert von Favipiravir war ähnlich (Tabelle S1 und S2; maximal ≥ 21- bzw. ≥ 4,8-fache Reduktion für SUDV bzw. MARV). Das mittlere KI für die Kombination aus RDV und Favipiravir betrug 1,12 für SUDV und 1,02 für MARV (Tabelle 2). Insgesamt scheint die Kombination dieser beiden Verbindungen also eine einfache additive und keine antagonistische antivirale Wirkung gegen SUDV und MARV zu haben. Um Software-Bias zu minimieren, haben wir auch SynergyFinder (Version 3) verwendet, um die Kombination von RDV + Favipiravir auf ihre Anti-MARV-Aktivität30 zu analysieren (https://synergyfinder.fimm.fi). Die Software ergab einen Synergiewert von 1,965, was darauf hindeutet, dass die Kombination additiv ist, basierend auf dem herkömmlichen Grenzwert der Synergiewerte: > 10 zeigt Synergie an, − 10 bis + 10 zeigt Additivität an und > 10 zeigt Antagonismus an (Abb. S1). Die Kombination der Verbindungen zeigte selbst bei den höchsten Konzentrationen beider Verbindungen keine Hinweise auf Zytotoxizität.

Achtzehn in SUDV- und MARV-Endemiegebieten häufig eingesetzte Therapeutika, darunter antivirale HIV-Therapien, Malariamedikamente und Medikamente zur Linderung der Symptome viraler hämorrhagischer Fieber (Tabelle S3, WHO 2010, 2016), wurden auf mögliche Wechselwirkungen mit RDV untersucht. Alle Medikamente wurden bei ihrer entsprechenden maximalen Konzentration im menschlichen Plasma (Cmax) getestet, es sei denn, es wurde eine erhebliche Toxizität beobachtet, was dann zu Tests bei einer niedrigeren Konzentration führte. Wie in Tabelle 3 zusammengefasst, werden die Medikamente in zwei Kategorien eingeteilt: (1) diejenigen, die im alleinigen Test keine antivirale Aktivität gegen SUDV und MARV aufweisen. Die meisten dieser Medikamente zeigten in Kombinationsstudien eine minimale Wirkung auf die RDV-Wirksamkeit, darunter Paracetamol, Artemether, Atovaquon, Diazepam, Metronidazol, Omeprazol, Ondansetron, Proguanil, Lamivudin, Ritonavir und Tenofovirdisoproxilfumarat (TDF); in der Erwägung, dass Amodiaquin und Ciprofloxacin die Aktivität von RDV gegen SUDV steigerten, indem sie den EC50-Wert um mehr als das Fünffache senkten; (2) Medikamente, die antivirale Aktivität gegen SUDV zeigten (Efavirenz, Lopinavir, Lumefantrin und Ceftriaxon, wurden allein oder in Kombination mit RDV getestet (Tabelle 3). Keines dieser Medikamente zeigte eine antagonistische Wirkung, wenn es in Kombination gegen SARS-CoV-2 getestet wurde mit RDV. Eine erhöhte Zytotoxizität wurde für Kombinationen von RDV mit Efavirenz und Atovaquon bei 41 bzw. 22,6 µM beobachtet. Diese Verbindungen zeigten eine ähnliche Zytotoxizität, wenn sie allein getestet wurden (CC50 ≈ 14–28 µM für Efavirenz und CC50 ≈ 8–17 µM für Atovaquon). .

Im Jahr 1998 veröffentlichten Barrett und sein Anthropologenkollege an der Emory University ihre Theorie über den Anstieg neu auftretender Infektionskrankheiten seit den späten 1970er Jahren, einschließlich der HIV-AIDS-Epidemie31. Sie schlugen drei epidemiologische Übergänge in der Geschichte der Menschheit vor, die durch ein einzigartiges Krankheitsmuster im Zusammenhang mit dem Lebensunterhalt und der damaligen Sozialstruktur definiert waren und jeweils mit einem Anstieg oder einer größeren Verschiebung der Auswirkungen von Infektionskrankheiten verbunden waren: (1) Der erste Übergang fiel mit der Jungsteinzeit zusammen Revolution, bei der viele der heutigen menschlichen Infektionen auf Zoonosen domestizierter Tiere zurückzuführen sind; (2) Der zweite Übergang erfolgte während der industriellen Revolution Mitte des 19. Jahrhunderts in Europa und Nordamerika, wo die Industrieländer einen deutlichen Rückgang der Sterblichkeit durch Infektionskrankheiten und einen damit einhergehenden Anstieg nichtübertragbarer Krankheiten wie degenerativer, metabolischer und altersbedingter Krankheiten erlebten. verwandte Krankheiten; (3) Der dritte Übergang wurde in den 1970er Jahren bei neu auftretenden Krankheitserregern beobachtet, die von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC)32 verfolgt wurden, darunter neu auftretende, wieder auftretende und arzneimittelresistente Viren. Zu den Faktoren, die zur Entstehung neuer Viren oder zum erneuten Auftreten von Viren beitragen, gehören der Klimawandel, ökologische Störungen, die Tiernahrungsindustrie, die Globalisierung und das Versagen des öffentlichen Gesundheitssystems31,33. Die COVID-19-Pandemie bestärkt die Vorstellung, dass künftige Virusinfektionen in kurzer Zeit globale Auswirkungen haben könnten, weshalb antivirale Medikamente mit einem breiten Wirkungsspektrum von entscheidender Bedeutung sind34. Die letzten zwei Jahre haben auch die Herausforderungen deutlich gemacht, die das Screening von Wirkstoffbibliotheken mit sich bringt, um inmitten einer Pandemie bestehende Arzneimittel für eine neue „umgewidmete“ Indikation zu identifizieren, während gleichzeitig versucht wird, den Prozess der qualitativ hochwertigen Identifizierung von Leitmolekülen und der vollständigen Optimierung niedermolekularer antiviraler Medikamente zu verkürzen oder zu umgehen Kandidaten35.

In dieser Studie haben wir die antivirale Breitbandaktivität von RDV gegen humanpathogene RNA-Viren bestätigt und gezeigt, dass RDV auch ein wirksamer Inhibitor von Picornaviren, pathogenen Flaviviren und endemischen Coronaviren ist. Die beobachtete antivirale Wirksamkeit von RDV gegen weitere Flaviviren und Filoviren steht im Einklang mit früheren Studien mit Mitgliedern dieser Virusfamilien10,13. Antivirale Aktivität wurde in mehreren Zelltypen mit unterschiedlichen Endpunktausgängen beobachtet: virale Antigenexpression, virale Replikation, Kopienzahl des viralen Genoms, zytopathische Wirkung und Reportergenexpression. Zu den Mitgliedern viraler Familien mit geringer oder keiner Empfindlichkeit gegenüber RDV gehören Orthomyxoviren (Influenza A und B), Nairoviren (Virus des hämorrhagischen Krim-Kongo-Fiebers), Phenuiviren (Rift-Valley-Fieber-Virus), Togaviren (Chikungunya-Virus und Alphaviren) und Rhabdoviren ( vesikuläres Stomatitis-Virus). Im Vergleich zu seinem Ausgangsnukleosid GS-441524 zeigte RDV in zellbasierten Tests eine stärkere antivirale Aktivität gegen HCV, DENV-2, YFV und WNV19, was wahrscheinlich mit der höheren Konzentration des in Zellen gebildeten aktiven 5'-Triphosphat-Metaboliten zusammenhängt3.

Zusätzlich zur Behandlung natürlicher Virusinfektionen besteht die Notwendigkeit, breitbandige antivirale Gegenmaßnahmen gegen Viren zu entwickeln, die als Kriegs- oder Bioterrorismusstoffe missbraucht werden könnten36. Für den Schutz vor unbekannten Krankheitserregern ist eine Kombination aus zwei oder mehr Breitband-Virostatika von Vorteil. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass RDV in Kombination mit dem Breitband-Antivirusmittel Favipiravir eine additive Wirkung hat, was die Kombination aus RDV + Favipiravir zu einer potenziellen Option in Bioverteidigungsszenarien macht.

Zellularen Untersuchungen zufolge weist RDV ein geringes Antagonismuspotenzial gegenüber anderen Begleitmedikamenten auf; Unsere Ergebnisse beschränken sich jedoch auf die In-vitro-Einstellung. Mögliche In-vivo-Arzneimittelwechselwirkungen sollten separat bewertet werden, da die Pharmakokinetik jedes Arzneimittels und seines Metaboliten durch viele Wirtsfaktoren beeinflusst werden könnte, die über den Rahmen dieser Studie hinausgehen. Seit April 2022 ist RDV von der FDA für die Behandlung von SARS-CoV-2 bei Erwachsenen und Kindern im Alter von 28 Tagen oder älter und einem Gewicht von ≥ 3 kg zugelassen37,38. Die etablierte antivirale Wirksamkeit, die klinische Sicherheit und das entsprechende Dosierungsschema als zugelassene Behandlung für COVID-19 sollten weitere in vivo- und klinische Tests von RDV gegen ein breiteres Spektrum von RNA-Viren ermöglichen, die in diesem Bericht angegeben sind. Laufende In-vivo-Bewertungen von RDV gegen neu auftretende Viren9,14 und die Wirksamkeit oral verfügbarer Prodrugs des RDV-Elternnukleosids könnten die Erweiterung der Behandlungsmöglichkeiten für vernachlässigte und neu auftretende Virusinfektionen unterstützen und möglicherweise dazu beitragen, mehrere ungedeckte medizinische Bedürfnisse bei Infektionskrankheiten, einschließlich zukünftiger antiviraler Medikamente, zu erfüllen Pandemievorsorge39,40.

Remdesivir wurde von Gilead Sciences, Inc. synthetisiert. Favipiravir (6-Fluor-3-oxo-3,4-dihydropyrazin-2-carboxamid; T-705) wurde von Fujifilm Toymana Chemical (Tokio, Japan) bezogen. E864-0360 wurde von ChemDiv (San Diego, CA) gekauft.

Zellen des menschlichen Gebärmutterhalskrebses (HeLa) (ATCC, Manassas, VA, Cat#CCL-2) wurden 3 Tage lang in T715- oder T225-Gewebekulturflaschen in Minimum Essential Medium (MEM) (Corning, Corning, NY, Cat#10-) kultiviert. 009), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Hyclone Laboritories/GE Health Care Life Sciences, Boston, MA), 10 % L-Glutamin (Hyclone Laboritories), 10 mM HEPES (pH 7,0–7,6) (Sigma-Aldrich). , St. Louis, MO), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) (Sigma-Aldrich), 1 % Penicillin/Streptomycin (Sigma-Aldrich). Um Testplatten zu erzeugen, wurden HeLa-Zellen mit 2.000 Zellen pro Well (insgesamt 40 μl pro Well) in bildgebenden Testplatten mit 384 Wells (Aurora Biotechnologies, Carlsbad, CA, Aurora 384, IQ-EB, 384 IQ-EB/) ausgesät. NB, 200 mklar, Kat.-Nr. 1052-11130) und vor der Behandlung mit den Verbindungen etwa 20 Stunden lang in einem Gewebekultur-Inkubator inkubiert.

Rhabdomyosarkomzellen (RD; CCL-136), H1-HeLa-Zellen (CRL-1958) und Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK; CCL-34) wurden von ATCC erhalten. Alle Zelllinien wurden entweder in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) (Gibco/Thermo Fisher Scientific) oder Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Gibco/Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % FBS, 2,0 mM L-Glutamin, 100 Einheiten, gezüchtet /ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin. Die Zellen wurden zweimal pro Woche in einem Aufteilungsverhältnis von 1:5 bis 1:10 unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechniken subkultiviert. Die Bestimmung der Gesamtzellzahl und der prozentualen Lebensfähigkeit erfolgte unter Verwendung eines Hämozytometers und unter Ausschluss von Trypanblau-Farbstoff. Die Lebensfähigkeit der Zellen, die in den Tests verwendet werden sollten, lag bei über 95 %. Die Zellen wurden am Tag vor dem Test in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät. Antivirale Tests wurden bei einer reduzierten FBS-Konzentration von 2 % durchgeführt.

Menschliche Adenokarzinom-H1-HeLa-Zelllinien (ATCC, Manassas, VA, Kat.-Nr. CRL-1958) wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt (Gibco/Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % FBS (v/v), gehalten.

Vero-Zellen und Huh-7-Zellen wurden von der America Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, MD) erworben. Vero-Zellen wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt, das 10 % FBS (HyClone Laboratories) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) enthielt, bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. Huh-7-Zellen wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 4 mM GlutaMAX, 110 mg/L Natriumpyruvat, 1 % NEAA, 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, gehalten. Sämtliche Kulturmedien, Nahrungsergänzungsmittel und Antibiotika wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) bezogen.

Die in den antiviralen Einführungstests verwendeten Infektionsmultiplizitäten (MOI) sind in Tabelle S4 zusammengefasst.

Der antivirale Test auf das humane Coronavirus OC43 (HCoV-OC43) war ein Anti-OC43-Nukleoprotein-ELISA. Konkret wurden Huh-7-Zellen in 96-Well-Platten (Corning Life Sciences, Durham, NA) mit 0,1 ml/Well und 0,144 × 106 Zellen/ml in Wachstumsmedium ausplattiert. Nachdem die Zellen über Nacht bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % (v/v) CO2 inkubiert wurden, wurden 0,1 ml pro Vertiefung mit dem Wachstumsmedium auf 1,103 × 104 pfu/ml verdünntes OC43-Virus zusammen mit der Serie in jede Vertiefung gegeben Verdünnte Testverbindungen, abgegeben mit einem digitalen HP D300e-Dispenser (Hewlett Packard, Palo Alto, CA) mit einem Endvolumen von 0,2 ml/Well. Die Kultur wurde 72 Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei 33 °C und 5 % (v/v) CO2 gehalten. Nach der Inkubation wurden die Kulturmedien entfernt und die Zellen mit 100 % Methanol für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Die Platten wurden zehn Minuten lang an der Luft getrocknet, nachdem das Fixiermittel entfernt wurde. Anschließend wurden die Platten mit 0,1 ml/Well 10 % FBS (Hyclone Laboritories), 5 % Trockenmilch (AmericanBio, Canton, MA), 0,1 % Tween 20 (EMD Millipore, Burlington, MA) in PBS (Blockierungspuffer) blockiert 30 Min. bei 37 °C. Nachdem der Blockierungspuffer entfernt worden war, wurden Anti-OC43-Nukleoprotein-Antikörper (EMD Millipore) 2000-fach mit dem Blockierungspuffer verdünnt und 50 µL in jede Vertiefung gegeben und zwei Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden dann fünfmal mit 0,2 ml pro Vertiefung 0,1 % Tween 20/PBS gewaschen und anschließend 50 µl pro Vertiefung mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Invitrogen, Waltham, MA) in einer Verdünnung von 1:4000 zugegeben im Sperrpuffer. Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurden die Platten fünfmal mit 0,2 ml pro Vertiefung 0,1 % Tween-20 in PBS gewaschen. Die HRP-Signale wurden durch Zugabe von 0,1 ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Reagens (Thermo Fisher Scientific) pro Vertiefung und Inkubation bei Raumtemperatur entwickelt, bis die positive Kontrolle sichtbar war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml/Well TMB-Stopplösung (LGC SeraCare, Milford, MA) gestoppt. Die Signale wurden durch Absorption bei 450 nm mit einem EnVision-Plattenlesegerät (Perkin Elmer, Waltham, MA) gemessen. Die Daten wurden mit der Prism-Software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) analysiert.

Um die Zytotoxizität der Verbindung zu testen, wurden Huh-7-Zellen in 96-Well-Platten (Corning Life Sciences) mit 0,1 ml/Well und 0,144 × 106 Zellen/ml in Wachstumsmedium ausplattiert. Nachdem die Zellen über Nacht bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % (v/v) CO2 inkubiert wurden, wurden 0,1 ml Wachstumsmedium pro Vertiefung zu jeder Vertiefung zusammen mit seriell verdünnten Testverbindungen hinzugefügt, die mit einem digitalen HP D300e-Dispenser (Hewlett) abgegeben wurden Packard) mit einem Endvolumen von 0,2 ml/Well. Die Kultur wurde 72 Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei 33 °C und 5 % (v/v) CO2 gehalten. Nach der Inkubation wurde die Lebensfähigkeit der Huh-7-Zellen mit dem CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega, Madison, WI) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Die Lumineszenzsignale wurden mit einem EnVision-Plattenlesegerät aufgezeichnet. Die relative Lebensfähigkeit der Zellen wurde berechnet, indem die Absorption der mit der Verbindung behandelten Vertiefungen auf die der mit DMSO behandelten Vertiefungen normalisiert wurde (auf 100 % eingestellt). Die relative Lebensfähigkeit der Zellen (Y-Achse) im Vergleich zu den log10-Werten der Verbindungskonzentration (X-Achse) wurde in der Software Prism (Version 8) aufgetragen. Die CC50-Werte (die Konzentration der Testverbindungen, die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen um 50 % zu reduzieren) wurden mithilfe eines nichtlinearen Regressionsmodells (vier Parameter) berechnet.

Der antivirale Test auf das humane Coronavirus 229E (HCoV-229E) war ein Anti-Nukleoprotein-ELISA mit infizierten H1-HeLa-Zellen. H1-HeLa-Zellen wurden in 96-Well-Platten (Corning) mit 0,1 ml/Well und 0,12 × 106 Zellen/ml in Opti-MEM (Gibco, Waltham, MA), ergänzt mit 2 % FBS, ausgesät und bei 37 °C inkubiert eine befeuchtete Gewebekulturkammer mit 5 % (v/v) CO2 über Nacht. Am nächsten Tag wurde die HCoV-229E-Stammlösung mit 2 % FBS in Opti-MEM auf 1,283 × 104 pfu/ml verdünnt und auf die 96-Well-Platten mit 0,1 ml pro Well verteilt. Die Testverbindungen wurden mit einem digitalen HP D300e-Dispenser mit einem Endvolumen von 200 µL/Well in jede Vertiefung verteilt. Nachdem die Platten eine Stunde lang bei 700 g bei Raumtemperatur zentrifugiert worden waren, wurden sie 0 oder 96 Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei 33 °C mit 5 % (v/v) CO2 gehalten. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Platten mit 100 % Methanol für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert. Anschließend wurde das Fixiermittel entfernt und die Platten 15–30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Anschließend wurden die Platten mit 0,1 ml/Well 10 % FBS (HyClone), 5 % Trockenmilch (AmericanBio), 0,1 % Tween 20 (EMD Millipore) in PBS (Blockierungspuffer) 30 Minuten lang bei 37 °C blockiert. Nachdem der Blockierungspuffer entfernt worden war, wurden 0,05 ml/Well 5000-fach verdünnter polyklonaler HCoV-229E-Nukleoprotein-Kaninchen-Antikörper (Sino Biological, Peking, China) im Blockierungspuffer zu jeder Vertiefung gegeben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden dann fünfmal mit 0,2 ml 0,1 % Tween-20/PBS pro Vertiefung gewaschen und anschließend 50 µl HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (ImmunoReagents, Raleigh, NC) 1:4000 verdünnt im Blockierungspuffer pro Vertiefung hinzugefügt . Nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C wurden die Platten fünfmal mit 0,2 ml pro Vertiefung 0,1 % Tween 20 in PBS gewaschen. Die HRP-Signale wurden durch Zugabe von 0,1 ml TMB-Reagenz (Thermo Scientific) pro Vertiefung und Inkubation bei Raum entwickelt, bis die Positivkontrolle sichtbar war. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml/Well TMB-Stopplösung (LGC SeraCare, Milford, MA) gestoppt. Die Signale wurden mit Absorption bei 450 nm mit einem EnVision-Plattenlesegerät gemessen. Nachdem die Hintergrundsignale bei 0 Stunden von denen bei 96 Stunden abgezogen wurden, wurde die relative Absorption berechnet, indem die Absorption der mit der Verbindung behandelten Gruppen auf die der mit DMSO behandelten Gruppen normalisiert wurde (auf 100 % eingestellt). EC50-Werte wurden mithilfe eines nichtlinearen Regressionsmodells mit vier Parametern und variabler Steigung berechnet.

Um die Zytotoxizität der Verbindung zu testen, wurden H1-HeLa-Zellen in 96-Well-Platten (Corning Life Sciences) mit 0,1 ml/Well und 0,12 × 106 Zellen/ml in Wachstumsmedium ausplattiert. Nachdem die Zellen über Nacht bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % (v/v) CO2 inkubiert wurden, wurden 0,1 ml Wachstumsmedium pro Vertiefung zu jeder Vertiefung zusammen mit seriell verdünnten Testverbindungen hinzugefügt, die mit einem digitalen HP D300e-Dispenser (Hewlett) abgegeben wurden Packard) mit einem Endvolumen von 0,2 ml/Well. Die Kultur wurde 96 Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei 33 °C und 5 % (v/v) CO2 gehalten. Nach der Inkubation wurde die Lebensfähigkeit der H1-HeLa-Zellen mit dem CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Die Lumineszenzsignale wurden mit einem EnVision-Plattenlesegerät aufgezeichnet. Die relative Lebensfähigkeit der Zellen wurde berechnet, indem die Absorption der mit der Verbindung behandelten Vertiefungen auf die der mit DMSO behandelten Vertiefungen normalisiert wurde (auf 100 % eingestellt). Die relative Lebensfähigkeit der Zellen (Y-Achse) im Vergleich zu den log10-Werten der Verbindungskonzentration (X-Achse) wurde in der Software Prism (Version 8) aufgetragen. Die CC50-Werte (die Konzentration der Testverbindungen, die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen um 50 % zu reduzieren) wurden mithilfe eines nichtlinearen Regressionsmodells (vier Parameter) berechnet.

Die Anti-Hepatitis-C-Virusaktivität wurde durch Hemmung der HCV-GT1b- und HCV-GT2a-Replikons in Huh-7-Zelllinien mit einem Hochdurchsatz-384-Well-basierten Luciferase-Reporter-Assay bestimmt. Subgenomische Replikonzelllinien GT1b und 2a. Beide Zelllinien wurden von Huh-7-lunet (Con1/SG-hRlucNeo) abgeleitet, das stabil ein subgenomisches HCV-Genotyp 1b- oder 2a-Replikon mit Renilla-Luciferase als Reporter beherbergt41.

Die Zelllinien wurden in DMEM gehalten, ergänzt mit GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 % FBS (Hyclone Laboratories, nicht hitzeinaktiviert), 0,5 mg/ml Geneticin (G418) (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 Einheiten/ ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) und 0,1 mM NEAA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Im Test wurden 2000 Zellen/Well in 90 µL Zellkulturmedium ohne G418 in Testplatten mit 384 Wells (Greiner Bio-One, Monroe, NC; zellkulturbehandelt) ausplattiert. Die Verbindungen wurden seriell (1:3) in DMSO verdünnt und 0,4 µL der verdünnten Verbindung wurden in jede Vertiefung gegeben, wodurch eine 10-Punkte-Dosistitration im Bereich von 2,3 nM bis 44 µM und eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,44 % erzeugt wurden. Die Verbindungen wurden in vierfachen Vertiefungen getestet. DMSO-Vehikel wurde als Negativkontrolle (Lösungsmittel; keine Hemmung) verwendet, und eine Kombination aus drei HCV-Inhibitoren, darunter ein Proteaseinhibitor, ein NS5A-Inhibitor und ein Nukleosidinhibitor, wurde in Konzentrationen > 100 × EC50 als Positivkontrolle verwendet ( 100 % Hemmung). Die Platten wurden 3 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 und 85 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.

Der HCV-Replikon-Assay war ein Multiplex-Assay, der zusätzlich zur Anti-Replikon-Aktivität (EC50) in derselben Vertiefung auch die Zytotoxizität (CC50) bewertete. Die Anti-HCV-Replikationsaktivität wurde durch das Lumineszenzsignal bestimmt, das von der Reporter-Renilla-Luciferase des HCV-Replikons erzeugt wurde. Der zytotoxische Effekt wurde durch die Umwandlung von Calcein AM in ein fluoreszierendes Produkt bestimmt. Normalisierte Aktivitäten in den Tests wurden unter Verwendung von Gleichung berechnet. (1):

wobei y = normalisierte % Zytotozität oder HCV-Replikon-Hemmung, XC = Fluoreszenzsignal von gut behandelter Verbindung; MB = Fluoreszenzsignal in Positivkontrollvertiefungen (100 % Hemmung), MD = Fluoreszenzsignal in DMSO-behandelten Vertiefungen (0 % Hemmung).

Um die entsprechenden CC50- und EC50-Werte zu bestimmen, wurden die Dosisreaktionen durch nichtlineare 4-Parameter-Regressionskurvenanpassung unter Verwendung von Gleichung analysiert. (2):

wobei y = % Zytotoxizität oder Replikonhemmung, m = Hill-Koeffizient, [I] = Inhibitorkonzentration, IC50 = CC50 für Zytotoxizität bzw. EC50 für HCV-Replikonhemmung.

Diese Tests wurden nach veröffentlichten Methoden42 durchgeführt. Huh-7-Zellen wurden mit 1,5 × 104 Zellen pro Vertiefung mit 2 % FBS in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen in Gegenwart zweifacher Reihenverdünnungen von RDV mit NanoLuc-Reporterviren infiziert. 48 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe von NanoGlo-Substrat, 1:100 verdünnt in NanoGlo-Assay-Puffer. Nach 3-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten mit einem BioTek Cytation 5-Plattenlesegerät gelesen. Alle NanoLuc-Reportervirus-Infektionstests wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt.

Die Lebensfähigkeit der Huh-7-Zellen wurde mit dem CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay Kit (Promega, Madison, WI) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Huh-7-Zellen wurden mit 1,5 × 104 Zellen pro Vertiefung mit 2 % FBS in einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C in 5 % CO2 wurden die Zellen mit zweifachen Reihenverdünnungen der Verbindung behandelt. 48 Stunden nach der Behandlung wurden CellTiter-Glo-Reagenzien in jede Vertiefung gegeben und das Lumineszenzsignal wurde mit einem BioTek Cytation 5-Plattenlesegerät aufgezeichnet. Die relative Lebensfähigkeit der Zellen wurde berechnet, indem die Absorption der mit der Verbindung behandelten Vertiefungen auf die der mit DMSO behandelten Vertiefungen normalisiert wurde (auf 100 % eingestellt). Die relative Lebensfähigkeit der Zellen (Y-Achse) im Vergleich zu den log10-Werten der Verbindungskonzentration (X-Achse) wurde in der Software Prism (Version 8) aufgetragen. Die CC50-Werte (die Konzentration der Testverbindungen, die erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der Zellen um 50 % zu reduzieren) wurden mithilfe eines nichtlinearen Regressionsmodells (vier Parameter) berechnet.

Tests zur Reduzierung der Virusausbeute für DENV-1 Djibouti D1/H/IMTSSA/98/606 (GenBank Accession AF298808)43, DENV-2 RL (GenBank Accession MW741553), DENV-3 H87-Prototypenstamm (GenBank Accession M93130)44, DENV- 4 Dakar_HD_34460 (GenBank Accession KF907503) und ZIKV MR766 (GenBank Accession DQ859059) unter Verwendung von Huh-7-Zellen wurden wie folgt durchgeführt: Huh-7-Zellen wurden in einer Dichte von 5,5 × 103 ausgesät (DENV-1, DENV-2, DENV- 3, DENV-4) oder 1,5 × 103 (ZIKV) Zellen pro Vertiefung in 100 μL DMEM/10 % FBS-Kulturmedium in 96-Well-Platten. Am nächsten Tag wurden die Zellen bei einer MOI von 0,01 mit DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 oder ZIKV, verdünnt in DMEM/5 % FBS-Assaymedium (150 μl pro Vertiefung), infiziert. Die Zellen wurden 2 Stunden lang inkubiert, danach wurde das virale Inokulum entfernt. Nach dem Spülen der Zellen mit Testmedium wurden den Zellen zweifache Reihenverdünnungen (Konzentration im Bereich von 100 bis 0,078 μM) von RDV in DMEM/5 % FBS-Testmedium zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 4 (DENV-1, DENV-2, DENV-3 und DENV-4) bzw. 7 (ZIKV) Tagen wurde der Überstand gesammelt und die Virus-RNA-Last durch quantitative RT-PCR (RT –qPCR) wie zuvor beschrieben45,46. Die antivirale Aktivität von RDV gegen YFV-17D Stamaril (Charge G5400; Sanofi-Pasteur) wurde in einem Test zur Reduzierung des zytopathischen Effekts (CPE) bestimmt. Der Assay wurde wie für DENV-1 bis DENV-4 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass RDV in Konzentrationen im Bereich von 100 bis 0,039 μM getestet wurde und die Auslesung (am Tag 4 nach der Infektion) durch kolorimetrische Auslesung unter Verwendung der MTS/PMS-Methode erfolgte ( Promega), wie zuvor beschrieben47. Der EC50, der als die Verbindungskonzentration definiert ist, die erforderlich ist, um die virale RNA-Replikation (für DENV und ZIKV) oder den virusinduzierten CPE (für YFV) um 50 % zu hemmen, wurde mittels logarithmischer Interpolation bestimmt.

Alle Experimente wurden in einem BSL-3-Labor durchgeführt. Huh-7-Zellen wurden mit Wildtyp-WNV bei einer MOI von 0,1 infiziert. Die infizierten Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an RDV behandelt. 48 Stunden nach der Infektion wurden Kulturflüssigkeiten gesammelt. Der Virustiter wurde durch Plaque-Assay an Vero-Zellen48 bestimmt. Die Lebensfähigkeit der Huh-7-Zellen wurde wie im Abschnitt „Antivirale Aktivität gegen DENV-1 (Westpazifik), DENV-2 (Neuguinea C), DENV-3 (VN32), DENV-4 (MY01), YFV (YFS11) beschrieben gemessen. , ZIKV (PRVABC59 und Dakar) und JEV mit NanoLuc-Luciferase-Reportern“.

Antivirale Bewertungen von RDV für Enteroviren, Rhinoviren und Influenzaviren wurden in RD-, H1-HeLa- bzw. MDCK-Zellen unter Verwendung von Tests zur zytopathischen Wirkung (CPE) durchgeführt. Virus und Zellen wurden in Gegenwart der Testverbindung gemischt und für die angegebene Dauer inkubiert. Das Virus wurde vorab titriert, sodass in den Kontrollvertiefungen ein Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen aufgrund der Virusreplikation von 85 bis 95 % auftrat. Daher wurde eine antivirale Wirkung oder Zytoprotektion beobachtet, wenn Verbindungen die Virusreplikation verhinderten. Der Zytoschutz und die Zytotoxizität der Verbindung wurden durch MTS-Farbstoffreduktion (CellTiter®96 Reagent, Promega) bewertet. Die prozentuale Verringerung der viralen zytopathischen Effekte (CPE) wurde bestimmt und zur Berechnung von EC50 (Konzentration, die die Virusreplikation um 50 % hemmt) und CC50 (Konzentration, die zu 50 % Zelltod führt) verwendet.

Die zellbasierten antiviralen Tests wurden in 384- oder 96-Well-Platten im BSL-4-Containment unter Verwendung eines High-Content-Imaging-Systems durchgeführt, um die Virusantigenproduktion als Maß für die Virusinfektion zu quantifizieren. Auf jeder Platte waren Kontrollvertiefungen mit der Bezeichnung „Kein Virus“ (BC) und Kontrollvertiefungen mit „0,5 % DMSO“ (NC) enthalten, um das 0- bzw. 100-prozentige Virusinfektionssignal zu bestimmen.

Für die Filovirus-Assays wurden zehn serielle Verdünnungen der Verbindung in dreifacher Ausfertigung 2 Stunden vor der Infektion direkt zu den Zellen gegeben, wobei der digitale Spender HP D300 in zweifachen seriellen Verdünnungsschritten verwendet wurde, beginnend bei 10 μM. Alternativ wurde eine zweifache serielle Verdünnungsreihe mit 8 RDV-Konzentrationen von 2,5 µM bis 20 nM verwendet. Die DMSO-Konzentration in jeder Vertiefung wurde mit einem digitalen HP D300-Dispenser auf 0,5 % normalisiert. Die Testplatten wurden in die BSL-4-Suite übertragen und mit SUDV- und MARV-Isolaten bei einem MOI infiziert, was dazu führte, dass 20 % bis 90 % der Zellen am Endpunkt des Tests Virusantigen exprimierten (Tabelle S4). Die Infektion wurde durch Fixieren der Zellen in Formalinlösung 48 oder 72 Stunden nach der Virusinokulation und vor der Immunfärbung beendet.

Die für die Kern- und Zytoplasmafärbung verwendeten primären und sekundären Antikörper und Farbstoffe sind in Tabelle S5 aufgeführt. Der für ein bestimmtes virales Antigen spezifische Primärantikörper wurde 1000-fach in Blockierungspuffer (1 × phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS; VWR, Bridgeport, NJ] mit 3 % Rinderserumalbumin [Lampire Biological Laboratories, Pipersville, PA]) verdünnt zu jeder Vertiefung der Testplatte gegeben. Die Testplatten wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Der primäre Antikörper wurde entfernt und die Zellen wurden dreimal mit 1 × PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit dem sekundären Nachweisantikörper, einem Anti-Maus-Immunglobulin G, konjugiert mit Dylight488 (Thermo Fisher Scientific), in einer 1:1000-Verdünnung in Blockierungspuffer inkubiert. Die Testplatten wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Kerne und Zytoplasma wurden mit Hoechst 33.342 (Thermo Fisher Scientific) und HCS CellMask Deep Red (Thermo Fisher Scientific) zum Nachweis von Kernen bzw. Zytoplasma gefärbt. Mindestens fünf Bilder pro Vertiefung wurden mit einem Opera-Konfokalplatten-Bildgebungsgerät (Perkin Elmer, Waltham, MA) unter Verwendung eines 10-fach-Luftobjektivs aufgenommen. Signale von Virusantigen-, Kern- und Zytoplasmafärbungen wurden bei Emissionswellenlängen von 488, 400 bzw. 640 nm nachgewiesen.

Die Bildanalyse wurde mit der Acapella-Bildgebungssoftware (Perkin Elmer, Waltham, MA) durchgeführt, die im Opera-Bildgebungssystem bereitgestellt wird (Modell 3842, vierfache Anregung mit hoher Empfindlichkeit [QEHS]; Perkin Elmer). Die Software wurde verwendet, um fundierte Ausgabeparameter zu erfassen, die zur Berechnung des Prozentsatzes infizierter Zellen, der prozentualen Hemmung und der prozentualen Lebensfähigkeit verwendet wurden. Der Prozentsatz der infizierten Zellen wurde mit Gleichung berechnet. (3) unten

Die Anzahl der viruspositiven Zellen (S) bezieht sich auf die Anzahl der Zellen in einer Probenvertiefung (S), deren virusspezifisches Signal über dem Schwellenwert liegt, während sich die Anzahl der Zellkerne (S) auf die Anzahl der Zellen in einer Probenvertiefung (S) bezieht ) mit Kernfärbungssignal über dem Schwellenwert. Der Prozentsatz viruspositiver Zellen wird von Acapella direkt berechnet und gibt den mittleren Prozentsatz der Zellen in einer Probenvertiefung (S) an, deren virusspezifisches Fluoreszenzintensitätssignal über dem Schwellenwert liegt.

Die Analyse der Dosis-Wirkungs-Kurve wurde mit der Genedata Screener-Software (Version 18.0, Lexington, MA, https://www.genedata.com/products-services/screener) unter Anwendung des Levenberg-Marquardt-Algorithmus für die Kurvenanpassungsstrategie durchgeführt. Die meisten Kurvenanpassungen wurden mithilfe einer nichtlinearen Regression mit 2, 3 oder 4 Parametern durchgeführt. Für jede Kurve wurden die folgenden Werte berechnet: absoluter EC50-Wert, gleich 50 % Infektionshemmung; Standardabweichung für EC50 innerhalb von 3 oder mehr technischen Replikaten; Hangneigung, wird zur Berechnung der EC90-Werte verwendet; %CC gibt CC50-Werte an, die 50 % der Zellzahlen entsprechen; und Selektivitätsindex (SI), der das Verhältnis von CC50 zu EC50 darstellt.

Die HepG2-NTCP-Zellen wurden durch Transfektion von Plasmid-DNA, die für das humane Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid-Gen (NTCP) kodiert, in HepG2-Zellen erzeugt. Klon HY12 wurde mit G418 selektiert und in Zellkultur für eine HBV-Infektion vermehrt. Die Zellen wurden mit einem aus HepAD38-Zellen stammenden Genotyp-D-HBV-Virus (AD38-Virus) mit 5000 Genomäquivalenten pro Zelle in Gegenwart von 4 % PEG 8000 und 1,5 % DMSO 20 Stunden lang infiziert und im Medium mit 1,5 % DMSO 3 Tage lang inkubiert nachdem Virus-Inokulums entfernt wurden49. Infizierte Zellen wurden in 384-Well-Platten (20.000 Zellen/Well) ausplattiert, 5 Tage lang mit Verbindungen behandelt und anschließend mit den Nachweiskits von Meso Scale Diagnostics (MSD) (Rockville, MD) wie zuvor beschrieben50 das HBsAg im Überstand gemessen .

Der Anti-HBV-Aktivitätstest in PHH wurde in einem 1536-Well-Format unter Verwendung einer veröffentlichten Methode50 durchgeführt. PHH-Zellen wurden 3 Tage lang mit dem AD38-Virus mit 500 Genomäquivalenten pro Zelle infiziert und dann trypsiniert und in Platten mit 1536 Vertiefungen (Greiner Bio-One, Monroe, NC; Zellkultur behandelt) mit 4000 Zellen/Vertiefung mit Kollagenbeschichtung ausplattiert ( Gibco/Thermo Fisher Sciences) von 1 μL bei 25 μg/ml vor der Zellaussaat. Die Verbindungen werden seriell (1:3) in DMSO verdünnt. In jede Vertiefung werden 10 nL der verdünnten Verbindung gegeben, beginnend mit einer Endkonzentration von 1 μM und einer DMSO-Endkonzentration von 1,5 % in einem Gesamtvolumen von 9 μL Kulturmedium. Für jede Wirkstoffkonzentration wurden in der 1536-Well-Platte Vierfachvertiefungen eingerichtet. Als Negativkontrolle wurden infizierte PHH-Zellen mit 1,5 % DMSO und als Positivkontrolle nicht infizierte PHH-Zellen verwendet (100 % Hemmung). Die Platten wurden 3 Tage lang bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 und 85 % Luftfeuchtigkeit inkubiert.

6 ml Zellüberstände wurden übertragen und die Hälfte der Überstände wurde zur Messung von HBsAg in einer anderen 1536-Well-Platte (Corning) verwendet, indem mit 5 ml der Detektions-HBs-Oberflächenantigen-Antikörpermischung des Kunden, markiert mit Tb und D2, inkubiert und zeitaufgelöst detektiert wurde Fluoreszieren Sie auf dem Envision-Plattenlesegerät (PerkinElmer). Die Zelltoxizität wurde durch Zugabe von 1 ml 2´ CellTiter-Glo (Promega)-Lösung in jede Vertiefung der Zellplatte nachgewiesen.

Die EC50-Werte wurden als die Konzentration der Testverbindung bestimmt, die eine 50-prozentige Abnahme des HTRF-Signals verursachte. Die CC50-Werte wurden als die Konzentration der Testverbindung bestimmt, die eine 50-prozentige Abnahme der Zelllebensfähigkeit verursachte.

Die Huh7-NTCP-Zellen wurden durch Transfektion von Plasmid-DNA, die für das humane Natriumtaurocholat-Cotransporting-Polypeptid-Gen (NTCP) kodiert, in Huh7-Zellen erzeugt. Es wurde ein einzelner Zellklon mit stabiler NTCP-Expression bei Kultivierung in Gegenwart von G418 ausgewählt. Der IF-Nachweis der HDV-Replikation wurde unter Verwendung des zuvor von Ni et al.51 beschriebenen Verfahrens mit Modifikationen durchgeführt. Kurz gesagt, die Zellen wurden 16 Stunden lang bei 37 °C mit HDV-Genotyp-1-Virus, hergestellt aus Huh7-END-Zellen52 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Stephen Urban, Universitätsklinikum Heidelberg, Deutschland), bei einem MOI = 1 in DMEM-Medien (Gibco) mit hohem Glucosegehalt in großen Mengen infiziert Enthält 4 % PEG 8000, 2,5 % DMSO, 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 Einheiten/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. Die Zellen wurden dann trypsinisiert und mit einer Dichte von 2000 Zellen/Well in 1536-Well-Platten (Corning) ausplattiert, die DMSO-Lösungen der Verbindung in unterschiedlichen Konzentrationen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 2,5 % DMSO, 100 Einheiten/ml Penicillin usw., enthielten 100 Einheiten/ml Streptomycin für 4 Tage. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit 5 % Formaldehyd fixiert und mit Maus-Anti-HDAg-Antikörper (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Stephen Urban, Universitätsklinikum Heidelberg, Deutschland) und AlexaFluor647-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (Invitrogen) auf HDAg gefärbt. Die Zellen wurden mit Hoechst 33.342 (Invitrogen) gegengefärbt, um Kerne zu identifizieren.

Die Zellen wurden mit der ThermoFisher CellInsight CX7 High Content Analysis-Plattform mit einem 10-fach-Objektiv abgebildet. HDAg wurde bei 650 nm abgelesen und die durchschnittliche Intensität der Kernregionen wurde zur Identifizierung von HDV-infizierten Zellen verwendet. Der Anteil der Zellen mit einer durchschnittlichen Intensität über dem Schwellenwert, der etwa 5 Standardabweichungen über dem Mittelwert für die nicht infizierte Kontrolle liegt, wurde für jede Erkrankung angegeben und zur Überwachung der HDV-Hemmung verwendet.

Die Kernzahl wurde bei 405 nm abgelesen und als Marker für Zytotoxizität verwendet.

Für die Datenanalyse wurde die Software GraphPad Prism 8 verwendet. Die Ergebnisse wurden auf Kontrollbrunnen normalisiert, die nur DMSO enthielten. Eine nichtlineare Regression wurde verwendet, um ein 4-Parameter-Modell (variable Steigung) an die Daten anzupassen.

Huh-7-Zellen werden in DMEM (Gibco/Thermo Fisher Sciences), ergänzt mit 10 % FBS (Hyclone Laboratories), in einem befeuchteten 5 % CO2-Inkubator bei 37 °C gezüchtet. Wenn Huh-7-Zellen zu 90–95 % konfluent sind, werden Einzelzellsuspensionen von Huh-7-Zellen durch Trypsinisierung hergestellt, zweimal mit serumfreiem Opti-MEM® (Invitrogen) gewaschen und bei 4 × 106 Zellen in 200 μL BTXpress resuspendiert ™ Puffer (VWR, Leuven, Belgien).

HEV-Kernow-C1-p6/luc-kodierende RNA wird in vitro aus MluI-verdauter Plasmid-DNA mit dem T7 RiboMAX Large Scale RNA-Produktionssystem (Promega) transkribiert und anschließend mit dem ScriptCap m7G-Capping-System (Cellscript, Madison, WI) gekappt.

Um die antivirale Aktivität von RDV zu bestimmen, werden 5 μg verkappte Kernow-C1 p6/Luc-RNA vorsichtig mit der oben genannten Zellsuspension in einer 4-mm-Küvette (VWR International) gemischt. Ein ECM 830 Electro Square Porator™ (BTX Harvard Apparatus, Holliston, MA) wird verwendet, um 5 Impulse bei 900 V und 99 μs zu liefern. Bei Zellkontrollvertiefungen wird virale RNA weggelassen. Die Zellen werden sofort in 20 ml vollständiges DMEM überführt und nach Bedarf für den Test ausgesät. Kurz gesagt, 100 μl-Aliquote der Zellsuspension werden in 96-Well-Platten ausgesät, die bereits Serienverdünnungen von RDV (100 μl, 2 × konzentriert) in vollständigem DMEM enthalten. Nach 4-tägiger Kultur bei 37 °C wurde der Grad der Virusreplikation anhand des Luciferase-Signals im Zellkulturüberstand bestimmt. Zwanzig μl des Kulturmediums werden auf eine weiße Kulturplatte mit 96 Vertiefungen (PerkinElmer) übertragen und die durch die sezernierte Gaussia-Luciferase (Gluc) erzeugte Lumineszenz wird nach Zugabe von 50 μl Renilla-Luciferase-Assay-Substrat (1:100 verdünnt; Promega) bestimmt. Die 50 % wirksame Konzentration (EC50) ist definiert als die Konzentration der Verbindung, die eine 50 %ige Verringerung der Lumineszenz (Luc-Signal) im Vergleich zu der der Viruskontrollen unter Verwendung von [Inhibitor] im Vergleich zur normalisierten Reaktion – Kurvenanpassung mit variabler Steigung (GraphPad Prism) verursacht , Version 8).

Zur Toxizitätsbewertung wird das Medium entfernt und durch 100 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2-tetrazolium/phenazinmethosulfat ( MTS/PMS; Promega) Lösung (1:10 verdünnt). Stoffwechselaktive Zellen wandeln das gelbe Substrat in einen braunen, wasserlöslichen Metaboliten um. Die Menge des produzierten Metaboliten steht in direktem Zusammenhang mit der Stoffwechselaktivität der Zellen, entweder in Gegenwart der Verbindung oder in Gegenwart sowohl der Verbindung als auch des Virus. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37 °C wird für jede Vertiefung die optische Dichte bei 498 nm bestimmt. Nach der MTS-Auslesung erfolgt die mikroskopische Auswertung (Qualitätskontrolle). Der CC50 stellt die Konzentration dar, bei der die Stoffwechselaktivität der Zellen unter Verwendung von [Inhibitor] vs. normalisierter Reaktion – Kurvenanpassung mit variabler Steigung (Graphpad Prism, Version 8) auf 50 % der Stoffwechselaktivität unbehandelter Zellen reduziert würde.

HeLa-Zellen, 384-Well-Platten und Virusbestände (MARV Ci67 und SUDV Boniface) sind die gleichen wie oben beschrieben. Favipiravir wurde von Fujifilm bezogen. Die Verbindungen wurden mit einem digitalen Spender HP D300 (Hewlett Packard) aus einem Stamm aus 100 % Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzugefügt, sodass jede Kombination in 4 Wiederholungen getestet wurde. Favipiravir wurde 4 Stunden nach der Zellplattierung (18–20 Stunden vor der Virusinokulation) in sechs Konzentrationen im Bereich von 23,4 nM bis 750 µM zugesetzt. RDV wurde den Zellen 2 Stunden vor der Virusinokulation in 9 verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 4 nM bis 1 µM zugesetzt. E864-0360, eine USAMRIID-Kontrollverbindung mit EC50 von 0,40 bzw. 0,65 µM gegen MARV, RAVV bzw. SUDV Boniface, wurde 2 Stunden vor der Virusinokulation in 10 unterschiedlichen Konzentrationen im Bereich von 50 nM bis 25 µM zugesetzt. Zur Festlegung von Referenzwerten für die Analyse wurden eine Blindkontrolle ohne Virusimpfung, eine neutrale Kontrolle mit Virusinfektion, aber ohne Behandlung und eine Vehikelkontrolle mit Virusinfektion und nur DMSO einbezogen. Die Zellen wurden mindestens 48 Stunden vor der Immunfärbung in 10 % gepuffertem Formalin fixiert. Das HCI-Maß der Virusinfektion wurde oben beschrieben.

Die kombinatorische Wirkung (additiv, synergistisch oder antagonistisch) von Favipiravir und RDV wurde mithilfe eines herkömmlichen Schachbrettaufbaus bewertet, bei dem die Dosis-Wirkungs-Wirkung einer Verbindung in Gegenwart steigender Konzentrationen der anderen Verbindung bewertet wurde. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung von RDV in Abwesenheit von Favipiravir und umgekehrt wurde im selben Test durchgeführt, um eine Kontrolle für die Bewertung der Kombinationswirkung zu erhalten. Die Analysesoftware Genedata Screener Synergy Module (Basel, Schweiz) wurde verwendet, um die Wirkung der Kombination mithilfe der mathematischen Modelle HSA (Highest Single Agent), Bliss Independence und Loewe zu quantifizieren53. Um Software-Bias zu minimieren, haben wir auch die Kombination von RDV + Favipiravir auf Anti-MARV-Aktivität mit SynergyFinder (Version 3.0)30 analysiert, wo Synergie-Scores gemeldet werden. Basierend auf dem konventionellen Cut-off gilt ein Synergiewert von -10 bis 10 als additiv.

Drei Parameter wurden verwendet, um den Kombinationseffekt in Abhängigkeit von den verschiedenen Modellen zu bewerten: (1) Der Kombinationsindex (CI) misst die fraktionelle Verschiebung zwischen den Kombinationsdosen und der prozentualen Aktivität einzelner Wirkstoffe. Sie ist unabhängig von einem Modell für die gemeinsame Wirkung der beiden Verbindungen. Ein CI-Wert von 1 weist auf eine additive Wirkung hin, ein Wert unter 1 auf synergistische Wirkungen und ein Wert über 1 auf einen Antagonismus zwischen den beiden Verbindungen. (2) Überschussvolumen bezieht sich auf die Summe der Unterschiede zwischen dem Modell und den angepassten Daten, multipliziert mit den Konzentrationsunterschieden zwischen den einzelnen Messungen. Positive Werte deuten auf synergistische Effekte hin, ein Wert nahe Null weist auf einen neutralen Kombinationseffekt hin und negative Werte deuten auf Antagonismus hin; (3) Der Synergiewert ähnelt dem Überschussvolumen, mit der Ausnahme, dass er die Daten nach Aktivitätswerten aus den ursprünglich gemessenen Daten gewichtet, wobei positive Werte das relative Maß an Synergie und negative Werte das relative Maß an Antagonismus angeben.

Therapeutika, die in SUDV- und MARV-endemischen Regionen verwendet werden, wurden auf mögliche Wechselwirkungen mit RDV untersucht (Tabelle S3). Zu den Medikamenten gehören antivirale HIV-Therapien, Malariamedikamente und Medikamente zur Linderung der Symptome viraler hämorrhagischer Fieber (WHO 2010, 2016). HeLa-Zellen, 384-Well-Platten und Virusbestände (MARV Ci67 und SUDV Boniface) sind die gleichen wie oben beschrieben. Jede Verbindung wurde in 8 Konzentrationen in 3–4 Wiederholungen mit einer dreifachen Verdünnungsstufe getestet. Jede Konzentration jeder Verbindung wurde aus einer Stammlösung unter Verwendung eines digitalen Spenders vom Typ HP D300 (Hewlett Packard) in die Testvertiefungen gegeben. Zur Festlegung von Referenzwerten für die Analyse wurden eine Blindkontrolle ohne Virusimpfung, eine neutrale Kontrolle mit Virusinfektion, aber ohne Behandlung, eine Vehikelkontrolle mit Virusinfektion, nur DMSO und die Positivkontrolle E864-0360 einbezogen. Für jede Verbindung wurden zwei Dosis-Wirkungs-Studien durchgeführt.

Zwei Stunden nach der Behandlung wurden die Platten zur Impfung mit SUDV Boniface (MOI = 7–16 pfu/ml) oder MARV Ci67 (MOI = 5–9 pfu/ml) in ein BSL-4-Labor überführt und 48 Stunden lang inkubiert. Die Infektion wurde durch Formalinfixierung beendet. Infektionen wurden mit HCI wie oben beschrieben gemessen. Die Analyse wurde wie oben in diesem Abschnitt „Remdesivir-Wechselwirkungen mit Begleitmedikamenten“ beschrieben durchgeführt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken Katrien Geerts, Caroline Collard und Elke Maas für die technische Unterstützung. Wir danken Becky Norquist für die Bearbeitung dieses Manuskripts.

Diese Arbeit wurde von Gilead Sciences, China Scholarship Council, 201906170033 finanziert.

Die Genfer Stiftung, Medizinisches Forschungsinstitut für Infektionskrankheiten der US-Armee (USAMRIID), Fort Detrick, Frederick, MD, USA

Sheli R. Radoshitzky, Patrick Iversen, Kelly S. Stuthman, Sean A. Van Tongeren, Jesse Steffens, Travis Warren und Jay Wells

Abteilung für antivirale Mittel, Amt für Infektionskrankheiten, Zentrum für Arzneimittelbewertung und -forschung, Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde, Silver Spring, MD, USA

Sheli R. Radoshitzky

Gilead Sciences, Inc, 333 Lakeside Drive, Foster City, CA, USA

Xianghan Lu, Ruoyu Gong, Hoa Truong, Annapurna A. Sapre, Huiling Yang, Xiaodong Xie, Jia Jun Chia, Zhijuan J. Song, Stacey M. Leventhal, Josolyn Chan, Alex Shornikov, David Cowfer, Helen Yu, Tomas Cihlar, Danielle P. Porter, John P. Bilello und Joy Y. Feng

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Institut für Arzneimittelforschung, Sealy Center for Structural Biology & Molecular Biophysics, Medical Branch der University of Texas, Galveston, TX, USA

Jing Zou & Pei-Yong Shi

KU Leuven, Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Transplantation, Labor für Virologie und Chemotherapie, Rega-Institut für medizinische Forschung, B-3000, Leuven, Belgien

Suzanne JF Kaptein, Xin Zhang und Johan Neyts

Global Virus Network, GVN, Baltimore, USA

Suzanne JF Kaptein, Xin Zhang und Johan Neyts

Laulima Government Solutions, LLC., Orlando, FL, USA

Travis Warren

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JYF, SRR, PI, XL, JZ, SJFK und JPB haben den Hauptmanuskripttext geschrieben. KSS, SAVT, JS, RG, HT, AAS, HY, XX, JJC, ZJS, SML, JC, AS, XZ und HY trugen zur Datenkuratierung, -analyse und -methodik bei. TW, JW, TC, JPB, JN und PYS konzipierten und überwachten die Arbeit. DC und DPP erleichterten die Aufzeichnung und den Material-/Datentransfer zwischen Institutionen. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Joy Y. Feng.

XL, RG, HT, AAS, HY, XX, JJC, ZJS, SML, JC, AS, DC, HY, TC, DPP, JPB und JYF besitzen potenzielle konkurrierende Interessen und die übrigen Autoren haben keine konkurrierenden Interessen. XZ erhielt Fördermittel des China Scholarship Council (Grant No.201906170033). Dieser Artikel spiegelt die Ansichten der Autoren wider und sollte nicht als Darstellung der Ansichten oder Richtlinien der FDA ausgelegt werden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Radoshitzky, SR, Iversen, P., Lu, X. et al. Erweiterte Profilierung von Remdesivir als Breitband-Antivirenmittel und geringem Potenzial für Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten in vitro. Sci Rep 13, 3131 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29517-9

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Eingegangen: 16. November 2022

Angenommen: 06. Februar 2023

Veröffentlicht: 23. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29517-9

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